Zwei Wissenschaftler der Goethe-Universität Frankfurt suchen nach Schwachstellen in den ausgeklügelten Abwehrsystemen von Bakterien. Ihr Ziel: Neue Ansätze zur Bekämpfung bakterieller Infektionen zu finden – etwas, worauf sie sich auch im Rahmen der SCALE-Clusterinitiative konzentrieren werden. Transportproteine sind Membranproteine, die die spezielle Aufgabe haben, sicherzustellen, dass Substanzen zwischen dem Zellinneren und dem extrazellulären Raum übergeben werden können. Eine große Familie dieser Transportproteine sind die sogenannten ABC-Transporter, wobei ABC für ATP-bindende Kassetten steht. Ihr charakteristisches Merkmal ist, dass sie energietragende Adenosintriphosphat (ATP)-Moleküle spalten, um die Energie freizusetzen, die sie benötigen, um Substanzen aktiv durch die Zellmembran zu transportieren. Diese charakteristische Klassifizierung als Teil der primären aktiven Transporterfamilie.
Clemens Glaubitz vom Institut für Biophysikalische Chemie der Goethe-Universität erforscht ABC-Proteine, die den Transport in Bakterien regulieren. Er spezialisiert sich auf Gram-negative Bakterien, zu denen Escherichia coli, Klebsiella und Acinetobacter baumannii gehören. Diese Bakterien besitzen nicht nur eine Membran, die den Zellinhalt umgibt und schützt (die Zellmembran), sondern auch eine zweite äußere Membran, die vom Periplasma von der inneren Membran getrennt ist. Die beiden Membranen sind unterschiedlich aufgebaut: Während die innere Membran aus einer symmetrischen Lipiddoppelschicht besteht, ist die äußere Membran asymmetrisch und enthält komplexe Verbindungen aus Fettsäuren und Lipopolysacchariden (LPS), also Polysacchariden. „Dies sind die wichtigsten Bestandteile der äußeren Membran. Sie helfen, die zelluläre Architektur der Bakterien aufrechtzuerhalten“, erklärt Glaubitz.
SCALE – Subzelluläre Architektur von LebendemZellen bestehen aus Milliarden von Molekülen, die als einzelne Moleküle, große molekulare Komplexe oder ganze Organellen organisiert sind. Während die Funktionen vieler einzelner Moleküle bekannt sind, ist in vielen Fällen unklar, wie die Architektur innerhalb einer Zelle entsteht und funktioniert, und wie ihre verschiedenen Bestandteile interagieren. Die Wissenschaftler bei SCALE möchten die Prinzipien der zellulären Selbstorganisation entdecken und eine Simulation der Zelle in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung erstellen. Am 2. Februar 2024 gab die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) bekannt, dass SCALE auf der Grundlage ihres Entwurfkonzepts im August 2024 einen vollständigen Vorschlag zur Förderung als Exzellenzcluster ab 2026 einreichen darf. https://scale-frankfurt.org
Die experimentelle Methode, die sein Team anwendet, wird als Festkörper-NMR-Spektroskopie bezeichnet. Während die Kernresonanzspektroskopie normalerweise erfordert, dass die untersuchten Proben löslich sind, sprechen wir von Festkörper-NMR-Spektroskopie, wenn die Technik auf nicht-lösliche Proben ausgedehnt wird. Die Forscher im Labor von Glaubitz haben entdeckt, dass MsbA – und seine verwandten ABC-Transporter in gramnegativen Bakterien – den Transport von Polysacchariden an Veränderungen in der Umgebung anzupassen scheinen. Dies bedeutet, dass das LPS-Transportsystem bei Bedarf effizienter werden kann. Glaubitz plant, MsbA als Modellprotein für alle anderen Systeme dieser Art in verwandten gramnegativen Bakterien, einschließlich Acetinobacter baumannii, zu verwenden. Auf die Frage, wohin diese Grundlagenforschung führen könnte, sagt er, dass LPS-transportierende Proteine wie MsbA in der Zukunft neue Ziele in der Behandlung bakterieller Infektionen unter Verwendung von Antibiotika werden könnten.
Der Antibiotikaeffluxpumpenforscher Klaas Martinus Pos untersucht, scheint auch den richtigen Aufbau der bakteriellen Zellhülle zu bestimmen. Die Architektur der Zellhülle muss intakt sein, damit Bakterien gegen Antibiotika resistent sein können. Aus diesem Grund untersucht Pos im Rahmen seiner Arbeit bei SCALE zusammen mit anderen Arbeitsgruppen eine Reihe von bakteriellen Zellhüllenarchitekturen. “Dies ist ein aufregender Bereich, über den bisher wenig bekannt ist. Vielleicht werden wir in Zukunft neue Möglichkeiten zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Bakterien entdecken.” Auch im Rahmen von SCALE untersucht Clemens Glaubitz die Transportproteine, die die doppelte Membran bei Gram-negativen Bakterien aufrechterhalten. Er konzentriert sich auf bakterielle Lipidvesikel, die aus der äußeren Membran ausgeschieden werden und offensichtlich direkt mit deren Resistenz- und Stressreaktionsmechanismen verbunden sind. “Darüber hinaus stellen wir unsere Erfahrung in der Festkörper-NMR-Spektroskopie SCALE zur Verfügung – eine Methode, die sich beim Analysieren von Proteinen und Lipiden in Membranen bewährt hat.”
Es ist auch wichtig, den Transport von Polysacchariden außerhalb der Zelle zu verhindern, um Krankheitserreger bekämpfen zu können. LPS bilden ebenfalls die erste äußere Barriere gegen Antibiotika. Sie tun dies, weil die Polysaccharide hydrophil sind, also Wasser anziehen, während Antibiotika hydrophob sind und daher fettanziehend sind. Dies ist der Grund, warum letztere im Allgemeinen nicht die äußere Membran durchdringen können. Wenn sie es schaffen, diese Barriere zu überwinden, werden sie sofort von einer zweiten Verteidigungslinie abgefangen, die Klaas Martinus Pos am Institut für Biochemie der Goethe-Universität untersucht. Er konzentriert sich auf die RND-Familie von Transportern, wobei RND für Resistance-Nodulation Division steht. Diese Transporter gehören zur Familie der sekundären aktiven Transporter, da sie die elektrochemischen Gradienten von Ionen nutzen, um die für den aktiven Transport benötigte Energie bereitzustellen.
Die Pumpen dieser Art fungieren wie Wächter, die verhindern, dass Antibiotika durch die innere Zellmembran in das Zytoplasma diffundieren. Eindringende Moleküle werden abgefangen, bevor sie so weit kommen, und aus der Zelle heraus und zurück in die Umgebung ausgeschieden. Während dieses Prozesses verwenden die ABC-Transporter das sogenannte Antiport-Mechanismus, erklärt Pos: “Sie transportieren die Ionen in eine Richtung, das Zellinnere, und die toxische Substanz in die entgegengesetzte Richtung, nach außen.” Po forscht auch an Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae Bakterien, die beide auf eine dreiteilige Effluxpumpe namens AcrAB-TolC angewiesen sind, deren Betrieb von seinem Labor entdeckt wurde: Während AcrB der eigentliche RND-Transporter ist, ist AcrA ein Adapterprotein, das sich im Periplasma befindet und den RND-Transporter mit dem dritten Pumpenbestandteil, dem Pore TolC in der äußeren Membran, verbindet. Alle drei zusammen bilden ein langes, flexibles Tunnelsystem, durch das Antibiotika aus der Zelle exportiert werden. “Diese tripartite Effluxpumpe ist extrem effizient. Sie erkennt fast alle bekannten Antibiotika und befördert sie aus.” Wissenschaftler sprechen auch von einer Multidrug-Effluxpumpe, die allein für die Resistenz bestimmter Bakterien gegen eine Vielzahl von Antibiotika verantwortlich ist (ein Phänomen, das als Multiresistenz bekannt ist).
Pos und sein Team haben auch entdeckt, wie die Effluxpumpe die benötigte Energie erhält. Sie bindet Protonen aus dem Periplasma und gibt sie ins Zytoplasma ab. “Die resultierenden elektrostatischen Veränderungen in der Membrankomponente der Pumpe sorgen dafür, dass die Antibiotikamoleküle im Tunnelsystem nur in eine Richtung bewegen, nach außen.” Der flexible Tunnelmechanismus ähnelt einer peristaltischen Pumpe wie der, die in unserer Speiseröhre zu finden ist und es uns ermöglicht, feste Nahrung zu uns zu nehmen, während wir kopfüber stehen: Die Nahrung, die wir schlucken, kommt im Magen an, obwohl die Schwerkraft entgegenwirkt. Die bakterielle Effluxpumpe verwendet denselben Mechanismus, um zu verhindern, dass die Antibiotika während des Ausscheidungsprozesses zurück in die Zelle gleiten.
Schnappschüsse der Effluxpumpe
Zu erfahren, wo und wie Antibiotika abgefangen und ausgeschieden werden, erfordert hochauflösende Strukturen, die – im Idealfall – einzelne Atome sichtbar machen. Pos’ Labor setzt speziell gezüchtete Kristalle ein, um Elektronendichtekarten zu erstellen, die dann zur Erstellung von 3-D-Strukturen der tripartiten Pumpen verwendet werden – ein Prozess, der auch mittels Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie durchgeführt werden kann. “Beide Methoden liefern Schnappschüsse, einzelne Bilder der Effluxpumpe bei der Arbeit, die wir nacheinander betrachten können. Es ist wie ein Daumenkino – wir können tatsächlich beobachten, wie das Antibiotikum durch den Tunnel gepumpt wird.” In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Achilleas Frangakis und dem Institut Pasteur in Lille entwickelte Pos’ Team mithilfe dieser Schnappschüsse neue Arten von Inhibitoren, also Substanzen, die die Multidrug-Effluxpumpe gezielt hemmen. “Dies könnte es uns ermöglichen, bakterielle Infektionen erneut effektiv mit vorhandenen Antibiotika zu bekämpfen, gegen die Bakterien bereits resistent geworden sind.” Die Wirkung der Inhibitoren wurde kürzlich in einem Lungenmodell an Mäusen nachgewiesen, die mit Klebsiella pneumoniae infiziert waren. Im Dezember 2023 erhielten Clara Börnsen und Reinke Müller, zwei Forscher aus Pos- und Frangakis’ Arbeitsgruppen, den Unibator-Innovationspreis der Goethe-Universität für ihre Arbeit im Rahmen des Projekts “Antibiotika reloaded”.
Grundlagenforschung zu Bakterienresistenzmechanismen ist dringend erforderlich, sagt Pos. „Derzeit sterben weltweit 1,3 Millionen Menschen jedes Jahr an multiresistenten Erregern. Wenn wir nicht jetzt handeln, können wir bis 2050 mit zehn Millionen Todesfällen pro Jahr rechnen.“ Das würde multiresistente Erreger noch tödlicher machen als Krebs heute ist.
